1、 材料与方法

1.1、试验材料  

稻壳粉、醋糟、玉米胚芽粕、麸皮、豆粕均为市售，嗜酸乳杆菌、酿酒酵母菌由本实验室活化所得。乳酸、赖氨酸、可溶性还原糖检测仪器为酶电极催化反应原理，商品名为发酵饲料分析仪。

1.2、试验处理  本实验共三个组别，每个组设置两个处理，每个处理三个重复。个处理是接种1%的嗜酸乳杆菌，置于37℃恒温厌氧培养7天，第二个处理是接种1%的酿酒酵母菌，置于28℃恒温厌氧培养7天。

1.3 检测方法

1.3.1 乳酸检测方法

 原理：采用特殊设计的乳酸氧化酶膜电化学传感器对乳酸浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的乳酸在固化的乳酸氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为丙酮酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出乳酸含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本乳酸浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。

样品测定 ：1 g 发酵饲料溶解于1 0 0 m L蒸馏水中，超声波溶解2分钟，4000 rpm离心 1 0分钟，取上清液1 ml于样品管中。按照仪器操作说明书进行操作

1.3.2 赖氨酸的检测

原理：采用特殊设计的赖氨酸氧化酶膜电化学传感器对赖氨酸浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的赖氨酸在固化的氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出赖氨酸含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本赖氨酸浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。

样品检测：

饲料游离氨基酸含量测定样品溶液制备：准确称取适量饲料（使样品中需测定的单个氨基酸含量在5～10mg或总氨基酸含量在100-150mg范围内），置于烧杯中，加0.1mol/L盐酸30mL，搅拌提取15min，静置5分钟，将上清液过滤到100mL容量瓶中，残渣加0.1mol/L盐酸25mL,搅拌3min，重复提取两次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗滤纸上的残渣，收集滤液并加0.1mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。

饲料中总赖氨酸的测定：按照GB/T18246-2000 采用酸水解，对发酵饲料进行处理。

1.3.3 可溶性还原糖的检测方法

 原理： 还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。一般以葡萄糖含量表示还原糖的含量。采用特殊设计的葡萄糖氧化酶膜电化学传感器对葡萄糖浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的葡萄糖在固化的葡萄糖氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为葡萄糖酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出葡萄糖含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本葡萄糖浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。

样品检测：准确称取发酵饲料1g,放入50ml烧杯中,在45℃水浴中加热1h ,并时时振摇，超声波提取10min，加入10ml6mol/L HCl溶液和15ml蒸馏水,混匀,在沸水中加热30min后,待水解完全后,冷却,加入酚酞指示剂,以10%NaOH溶液中和至溶液pH呈中性,滤过并定容至100ml,静置。吸取上清液用干燥滤纸过滤,弃去初滤液,取后续滤液备用。吸取500微升与样品管中，按照仪器操作说明进行操作。

2.实验结果及分析

原料的品种，产地，加工方式，配方比例等对发酵初始pH会有较大影响，从而直接影响微生物的生长环境，对发酵终pH、产酸率、代谢产物等可能会有一定的影响。下一步我们会设计实验去验证。

 传统的检测乳酸的方法有主要有羟基联苯比色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法(HPLC）。EDTA定钙法虽然操作简便，检测时间也不太长，但检测准确性差，误差较大，结果较不可靠，并且发酵饲料中组份复杂，干扰性离子较多。 高效液相色谱法具有专一性强，结果准确可靠等特点，但对于从发酵饲料复杂组份中分离出乳酸，对仪器和操作者的前处理水平都有很高要求，并且检测成本、仪器投资也较高。赖氨酸的检测一般用氨基酸分析仪或者比色法，前处理复杂，检测仪器昂贵。还原糖检测一般采用DNS比色，斐林试剂滴定等常规的化学方法，优点是操作简单，检测成本低廉，缺点是检测时间长，分辨率差，专一性差，发酵饲料中存在较多的干扰因素。鉴于目前发酵饲料企业大多是中小型企业，资金，技术，管理等资源有限，一次性投入高校液相色谱、氨基酸分析仪等大型仪器比较困难。所以选择一种适合当前发酵饲料企业使用，一次性投资少，单次检测成本低，操作简单，检测专一性强的检测方法对于促进发酵饲料工业的健康发展具有重大意义。本文中用到的酶电极的检测方法具有以上有点并且检测速度很快，一个样品耗时一分钟左右能同时检测乳酸、赖氨酸、可溶性还原糖等指标。